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隋雨蒙【短篇论著】皂荚提取物对肝癌大鼠微小RNA21及磷酸酶及张力蛋白同源基因的影响-中华肝脏病杂志

1 全部文章 | 2019年03月17日

隋雨蒙【短篇论著】皂荚提取物对肝癌大鼠微小RNA21及磷酸酶及张力蛋白同源基因的影响-中华肝脏病杂志

隋雨蒙 点击标题下「蓝色微信名」可快速关注
文章来源:中华肝脏病杂志, 2018,26(2): 142-144
作者:蔡岳詹磊张赤志王晓东陆定波程良斌许汉林王学书
微小RNA(miRNA)调节着人类三分之一的基因。而miR-21是众多miRNAs中国际公认的癌基因之一,当抑制miR-21表达时,人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)表达升高,肝癌细胞的生长、侵袭、和迁移也受到抑制。我们前期研究结果显示,皂荚提取物能够调节多种信号通道,发挥抗肝癌的作用[1,2,3]。为了进一步阐明该药治疗肝癌的作用机制,本实验以肝癌大鼠miR-21及其靶基因PTEN为研究对象,探讨皂荚提取物抗肝癌效应中可能的新作用靶点及其机制。
一、材料与方法
1.实验材料:
肝癌细胞walker-256,购于上海拜力生物科技有限公司。断奶雄性Wistar大鼠5只,体质量约100 g,购于湖北省实验动物研究中心,供肿瘤传代使用。雄性SD大鼠60只,体质量180~220 g,购于湖北省实验动物研究中心。猪牙皂购自湖北省药材公司,猪牙皂提取物正丁醇由湖北中医药大学药学院许汉林教授制作;索拉非尼(200 mg/粒)购自德国拜耳制药公司。
2.动物模型:
将Walker-256细胞株经过水浴、离心、清洗、重悬细胞后分别注入5只Wistar大鼠的腹腔内,每只1 ml。14 d后观察大鼠腹部膨隆,癌性腹水形成。抽取淡红色洗肉水样癌性腹水5 ml,离心、弃上清液,再抽取浓缩腹水备用。将SD大鼠麻醉,剪开腹部并逐层分离,选取最外层肝叶,将装有癌性腹水的注射器倾斜进针刺入肝叶内约0.5 cm,轻轻推送注射器注入制备的癌性腹水约0.05 ml(对照组注入等渗盐水0.05 ml,余步骤同肝癌组),然后止血、缝合、消毒。
3.实验分组及给药:
将60只约200 g的SD大鼠按体质量平均分为6组,每组10只。根据人临床用量(猪牙皂0.021 g·kg-1·d-1,索拉菲尼0.8 g/d)及人与大鼠体表面积折算的等效剂量计算灌胃剂量,按1∶2∶4设置皂荚提取物低剂量组(128.57 mg·kg-1·d-1) 、中剂量组(257.14 mg·kg-1·d-1)和高剂量组(514.28 mg·kg-1·d-1),索拉非尼组(68.57 mg·kg-1·d-1);空白组和模型组给予0.9%等渗盐水10 mg·kg-1·d-1,各组灌胃体积相同;移植后1周后开始治疗;各组连用28 d。终止治疗时间为移植后35 d。
4.Western blot检测PTEN蛋白的变化:
细胞裂解液提取总蛋白,按照二辛可酸蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,经过电泳、转膜、抗体孵育等步骤,然后化学发光试剂显影,凝胶成像系统采集图片。
5.实时荧光定量PCR检测miR-21和PTEN基因表达量:
按照miRNA提取试剂盒提取肝癌细胞总miRNA,通过miRNA-21反转录引物进行反转录,以反转录产物为模板进行PCR扩增。内参照基因为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),采用miR-21/U6和PTEN/GAPDH,以2-△Ct表示miR-21和PTEN基因的相对表达量。
6.TUNEL细胞凋亡检测凋亡指数:
取上述各组切片,实验步骤按照TUNEL试剂盒说明进行操作,DAB显色,苏木素复染,封片。显微镜下观察、采集图片。
7.统计学方法:
数据用均数±标准差(±s)表示,各变量的组间两两比较采用单因素方差分析,检验水准α= 0.05,P< 0.05为差异有统计学意义。
二、结果
1.各组大鼠肝癌组织病理学变化:
模型组中大部分肝小叶被肿瘤组织代替,肝窦扩张,肝血窦周围可见纤维组织增生。汇管区有大量的成纤维细胞、纤维细胞。肿瘤细胞呈圆形,再生活跃,异型性明显,细胞核染色变深,核质比变大,部分出现核固缩和核碎裂现象,肿瘤细胞呈团块状分布,部分出现凝固性坏死,染色呈深红色。皂荚提取物低、中剂量与模型组相比,可见肝小叶失去正常结构,但肿瘤组织、异型性细胞数量和过塑细胞数量减少,核质比较大的细胞数量也明显减少。皂荚提取物高剂量组肝小叶结构相对清晰完整,细胞胞质胞核均匀,部分细胞有核固缩和异型性的现象,但是较模型组状态改善很明显。索拉菲尼组的形态学较模型组改变最为明显,并且最接近于空白组,肝小叶结构基本清晰完整,细胞胞质胞核均匀,肝细胞索排列整齐,肝窦内及汇管区可见少量淋巴细胞浸润,少见纤维组织增生(图1)。



A:空白组;B:模型组;C:皂荚提取物低剂量组;D:皂荚提取物中剂量组;E:皂荚提取物高剂量组;F:索拉菲尼组
图1 各组大鼠肝癌组织HE染色 ×200
2.皂荚提取物对大鼠肝癌组织中PTEN mRNA和蛋白表达的影响:
应用实时荧光定量PCR和Western blot检测大鼠肝癌组织中PTEN mRNA和蛋白的表达水平,见表1及图2。通过单因素方差分析,6组大鼠肝癌组织PTEN mRNA和蛋白表达水平比较,F值分别为371.346、139.797,P值均<0.05,差异均有统计学意义。


注:PTEN:磷酸酶及张力蛋白同源基因;β-actin:β-肌动蛋白;1:空白组;2:模型组;3:皂荚提取物低剂量组;4:皂荚提取物中剂量组;5:皂荚提取物高剂量组:6:索拉非尼组
图2 Western blot检测各组PTEN蛋白表达
3.皂荚提取物对大鼠肝癌细胞凋亡的影响:
采用TUNEL细胞凋亡检测技术,观察每组6张切片的细胞凋亡情况(图3),每个切片取4个视野,显微镜下组织切片上凋亡的细胞为棕褐色,经Iimage-Pro Plus图像分析软件处理,定量分析肝癌细胞的凋亡指数(表2)。通过ANOVA检测,六组间比较差异有统计学意义(F= 19.364,P<0.05)。


注:A:空白组;B:模型组;C:皂荚提取物低剂量组;D:皂荚提取物中剂量组;E:皂荚提取物高剂量组:E:索拉非尼组
图3 TUNEL检测的各组组织切片×400
4.皂荚提取物在抗肝癌效应中对肝癌大鼠miR-21的影响:
通过实时荧光定量PCR检测肝癌细胞中miR-21的表达水平(表3和图4),6组miR-21的表达量有显著性差异(F= 648.079,P<0.05);各组间两两比较,皂荚提取物高剂量组和索拉非尼组比较差异无统计学意义(t= 1.147,P>0.05)。


注:1:空白组;2:模型组;3:皂荚提取物低剂量组;4:皂荚提取物中剂量组;5:皂荚提取物高剂量组:6:索拉非尼组
图4各组大鼠组织中微小RNA-21的表达量
三、讨论
MiR-21靶基因有抑癌基因PTEN、程序性细胞凋亡因子4、金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP3)、乳腺丝抑蛋白等。PTEN是具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,miR-21能够通过与PTEN mRNA3’UTR互补结合来降解PIEN mRNA或直接抑制其翻译,从而诱导肿瘤发生。
皂荚提取物能诱导人肝癌细胞的凋亡[1]。本课题组前期通过一系列研究,结果[2,3]显示皂荚提取物可通过抑制增殖,从而起到抗肝癌的作用。我们最近在与索拉非尼体外对照的实验研究中发现,皂荚提取物能够阻断PTEN-PI3K/AKT/mTOR/Caspase9信号通路,抑制肝癌细胞SMMC-7721增殖和促进其凋亡。
本研究通过动物实验,研究皂荚提取物对肝癌大鼠miRNA-21及其靶基因PTEN的影响,进一步寻找皂荚提取物抗肝癌效应中的作用机制。实验结果显示,在细胞凋亡、miR-21和PTEN的表达水平,皂荚提取物高、中、低剂量组及索拉非尼组较模型组比较,差异有统计学意义,说明皂荚提取物具有显著的抗肝癌效应,且该效应与miR-21/靶基因PTEN有关。皂荚提取物在抗癌效应中能够使miR-21下调,同时促进抑癌基因PTEN基因和蛋白的上调。皂荚提取物高剂量组其对miR-21和PTEN的影响均要优于低剂量组和中剂量组,并且与索拉非尼组比较无明显差异,更进一步阐述了皂荚提取物治疗肝癌有效剂量和可能的分子机制。有助于了解皂荚提取物的抗肝癌活性,发现抗肝癌效应中的新治疗靶点,为中药皂荚的临床应用提供帮助。但中药皂荚的有效成分较为复杂,其抗肝癌作用的有效成分筛选还有待我们进一步研究。
参考文献(略)

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